2011年7月21日 星期四

從3億到1000:3天定序是怎麼辦到的?

A $1000 Genome by 2013? - ScienceNOW

還記得五月在德國開始流行的出血性大腸桿菌O104嗎?後來這隻大腸桿菌,在三天之內就定序完成,不知道有沒有人想到是怎麼辦到的啊?

當時的文章裡面只提到是所謂的第三代的定序儀,但沒有說第三代的定序儀是怎麼回事,畢竟它雖然不大,但也有460萬個鹼基對(base pairs),要在三天內定序完真的是很不容易。

今天在「自然」期刊上面的一篇文章,說明了第三代定序儀是怎樣辦到的。

最早的定序,是使用同位素(磷32或硫35)標定的雙去氧核糖核苷酸(dideoxy nucleotide),利用DNA鏈延長需要核糖上面的3號碳的OH基與下一個核苷酸上面的磷酸根反應,當我們以人工合成3號碳上帶有H基的核苷酸(雙去氧核糖核苷酸),並將它加入反應時,一旦DNA聚合酶抓到一個雙去氧核糖核苷酸後,會因為產生的DNA末端的3號碳不具有OH基,使DNA聚合反應終止。接著再用凝膠電泳把一條條DNA分開後,讓乾燥的電泳膠片上面的同位素信號在X光片上面顯影,接著就是讀出序列了。

圖片來源:維基百科
上圖就是壓出來的X光片,然後我們就是一個一個序列去讀。純苦工。做反應、跑膠、壓片、讀序列,整個再快也要三天,然後讀出500鹼基對的序列。所以,如果用大腸桿菌來算,460萬個鹼基對,大概需要10,200個定序反應,如果從兩頭一起做,大概需要15,300天才做得完,也就是要42年~

當然,實際上我們都知道當時是很多實驗室一起做,同時技術也在進步,所以並沒有花那麼久的時間來訂出大腸桿菌的序列。

後來,開始有所謂的自動定序儀,雖然一樣是用雙去氧核糖核苷酸,但是這回這些雙去氧核糖核苷酸上面放了不同顏色的發色基,跑膠的部分則是以毛細管電泳來代替,由於這些雙去氧核糖核苷酸上面帶有不同的顏色(核苷酸只有四種,A腺嘌呤,T胸腺嘧啶,G鳥糞嘌呤,C胞嘧啶),當用雷射刺激的時候會發出不同的色光,然後由偵測器來判讀。讀出來的東西像下圖這樣:


圖片來源:維基百科
由於偵測儀器的敏感度較高,自動定序儀至少可以讀到700個鹼基對,如果遇到技術好的公司,甚至還可以更多。目前大部分實驗室送定序都是用這樣的儀器。但是還是相當耗時費事囉,只是耗時費事的不是學生或博士後研究員,而是廠商。


那第三代是怎麼回事呢?第三代定序完全揚棄了使用雙去氧核糖核苷酸!他們利用DNA進行鏈延長反應時,每併入一個核苷酸會產生一個氫離子(H+),使用晶片(ISFET, ion-sensitive field-effect transistor)來偵測由於氫離子的產生造成的酸鹼度的改變(下降0.02pH),得知是否有DNA的合成。

要定序的DNA先打碎,接上帶有已知序列的adaptor DNA並固定在直徑為2微米(2μm)的珠子上,然後將珠子放進有晶片的小洞裡。

圖片網址:自然期刊網站
中間那個圖就是一個個小洞,下面是晶片。

藉由儀器不斷的重複加入四個核苷酸的溶液(中間當然要洗乾淨),偵測,如果使用有120萬個小洞的晶片,跑兩個鐘頭的反應可以讀出2千5百萬個鹼基對!所以大腸桿菌460萬算什麼呢?

當然可能有讀者想,如果兩個鐘頭就可以把大腸桿菌定序完,為什麼上次花了三天呢?事實上定完序列是一件事,但是要把一段段的序列組合、確認、分析,這些部分才是更花時間的。光把一堆ATGC交出來是沒有用的,要整理要分析才能發揮功用不是嗎?所以上次花了三天其實是包括瞭解這大腸桿菌不簡單,它是一個集各家所長的大腸精,這並不是定序儀可以做到的。

定序得那麼快,準確嗎?目前根據研究團隊的分析,準確度比起過去的方法是差不多的,但是光是可以在兩小時內讀出2千5百萬個鹼基對,傳統的定序就遠遠不及啊!更不用提第一次定人類基因序列時,花了3億美金定完3億個鹼基對(真是字字珠璣),以目前的第三代定序儀,未來想要瞭解你自己,可以先花個1000美金把自己的基因定序一下,再請電腦分析、分析,或許比什麼血型、星座更準確喔!

筆者想到當年當研究生的時候,花了半年的功夫定出一萬個鹼基對(10 kb)的序列,看到現在2小時就可以定2千5百萬個,真覺得自己老了....

2011年7月18日 星期一

吹綿介殼蟲的獨白:誰需要男人?

ScienceShot: Sex and the Single Insect - ScienceNOW
圖片來源:Science Now

喜愛園藝的人都知道吹綿介殼蟲是最難殺的幾種害蟲之一,但可能還不知道一件事:雖然吹綿介殼蟲有公有母,但雌性吹綿介殼蟲(Icerya purchasi)只要交配一次,就可以幾乎不用再交配了,而且它可以把這一次交配得來的精子留存在體內,提供下幾代的吹綿介殼蟲使用--對,你沒有看錯,的確是下幾代,也就是雌性吹綿介殼蟲會把這次交配得來的精子傳給下一代的吹綿介殼蟲,下一代又會傳給下下一代...

過去認為這樣對於雌性吹綿介殼蟲是有害的,因為牠必須要耗費體力來保存這些精子,如果不用保存這些精子,雌性吹綿介殼蟲應該可以生更多蛋?不過最近的研究發現,這樣保存精子的機制對於吹綿介殼蟲來說是有好處的,因為牠可以保持品系的純度。當然,交配一次後N代內不用再交配,對於雄性的吹綿介殼蟲來說是壞消息,不過對吹綿介殼蟲自己來說,能把血脈傳下去就OK了,誰在乎男人呢?

筆者覺得要好好研究一下他們怎樣保存精子的,不用冷凍就可以保存,還可以世世代代保存下去,實在是不得了啊!如果我們可以了解其中的關鍵,是不是精子銀行的開銷可以降低呢?

2011年7月15日 星期五

高處不勝寒的高階草原狒狒

ScienceShot: It's Lonely—And Stressful—At the Top - ScienceNOW

圖片來源:Science Now

要當美猴王並不容易,由於草原狒狒(savanna baboons, Papio cynocephalus)的猴王的權力經常受到低階狒狒的挑戰,他們可以說是每天都跟壓力共存。


每天生活在壓力下,使得他們的分泌的壓力賀爾蒙(stress hormone, 在本文中為testosterone and glucocorticoid)量與低階狒狒不同。


科學家們分析草原狒狒的糞便,發現最高階的草原狒狒(alpha male)的testosterone(睪固酮)以及glucocorticoid(腎上腺糖皮質素)含量較低階的草原狒狒高了數倍,而較高階的草原狒狒則是睪固酮較高但腎上腺糖皮質素較低。這個現象,即使在階級相當穩定的草原狒狒族群裡也一樣。


由於之前的研究發現,生活在持續的壓力下會造成免疫系統功能障礙,同時對健康也不好。大猩猩的研究也發現,階級較高的大猩猩分泌較多的睪固酮,但腸道裡面的寄生蟲也比低階的大猩猩要多得多,可見對靈長類來說,位高權重其實並不是如大家想像的那麼開心,事實上這些上位者在健康上也付出了相當大的代價喔!


參考資料:ScienceShot: The Downside of Manliness - ScienceNOW

2011年7月1日 星期五

水船蟲(Water Boatman)的小弟弟之歌

ScienceShot: Tiny Bug Makes a Riot With Its Privates - ScienceNOW

人用嘴唱歌,有些人可以用手指頭或其他部位發出聲音;昆蟲有摩擦翅膀或以腹部的氣孔發出聲音的,但是Micronecta scholtzi,俗名Water Boatman(水船蟲)發出聲音的方法卻異於常蟲。
圖片連結網址:Science Now


科學家發現,水船蟲用他的小弟弟(penis)發出聲音。水船蟲的小弟弟位於腹部的溝槽內,而牠發聲的方法是把小弟弟在溝槽內搖晃。


認為這樣發出的聲音很小嗎?錯了!水船蟲的小弟弟之歌有99.2分貝,相當於貨運列車的聲音,所以雖然水船蟲求偶時(對,牠的小弟弟之歌還是為求偶而唱)是在水底下唱牠的小弟弟之歌,但是這樣大的聲音,我們如果經過河岸還是會聽到喔!


猜猜看水船蟲有多大隻?其實這小傢伙體長才兩毫米(2mm),真的是好小好小,而發聲的部位才不過像頭髮那麼細,想到這個就不得不佩服牠囉!


只是老葉想:在交配前他就把小弟弟操得這麼狠,都不會累啊?迷信壯陽效果的人是不是要考慮一下拿牠去泡酒喝呢?(開玩笑的~)