還記得五月在德國開始流行的出血性大腸桿菌O104嗎？後來這隻大腸桿菌，在三天之內就定序完成，不知道有沒有人想到是怎麼辦到的啊？
當時的文章裡面只提到是所謂的第三代的定序儀，但沒有說第三代的定序儀是怎麼回事，畢竟它雖然不大，但也有460萬個鹼基對(base pairs)，要在三天內定序完真的是很不容易。
今天在「自然」期刊上面的一篇文章，說明了第三代定序儀是怎樣辦到的。
最早的定序，是使用同位素(磷32或硫35)標定的雙去氧核糖核苷酸(dideoxy nucleotide)，利用DNA鏈延長需要核糖上面的3號碳的OH基與下一個核苷酸上面的磷酸根反應，當我們以人工合成3號碳上帶有H基的核苷酸（雙去氧核糖核苷酸），並將它加入反應時，一旦DNA聚合酶抓到一個雙去氧核糖核苷酸後，會因為產生的DNA末端的3號碳不具有OH基，使DNA聚合反應終止。接著再用凝膠電泳把一條條DNA分開後，讓乾燥的電泳膠片上面的同位素信號在X光片上面顯影，接著就是讀出序列了。
上圖就是壓出來的X光片，然後我們就是一個一個序列去讀。純苦工。做反應、跑膠、壓片、讀序列，整個再快也要三天，然後讀出500鹼基對的序列。所以，如果用大腸桿菌來算，460萬個鹼基對，大概需要10,200個定序反應，如果從兩頭一起做，大概需要15,300天才做得完，也就是要42年～
當然，實際上我們都知道當時是很多實驗室一起做，同時技術也在進步，所以並沒有花那麼久的時間來訂出大腸桿菌的序列。
後來，開始有所謂的自動定序儀，雖然一樣是用雙去氧核糖核苷酸，但是這回這些雙去氧核糖核苷酸上面放了不同顏色的發色基，跑膠的部分則是以毛細管電泳來代替，由於這些雙去氧核糖核苷酸上面帶有不同的顏色（核苷酸只有四種，A腺嘌呤，T胸腺嘧啶，G鳥糞嘌呤，C胞嘧啶），當用雷射刺激的時候會發出不同的色光，然後由偵測器來判讀。讀出來的東西像下圖這樣：
由於偵測儀器的敏感度較高，自動定序儀至少可以讀到700個鹼基對，如果遇到技術好的公司，甚至還可以更多。目前大部分實驗室送定序都是用這樣的儀器。但是還是相當耗時費事囉，只是耗時費事的不是學生或博士後研究員，而是廠商。
那第三代是怎麼回事呢？第三代定序完全揚棄了使用雙去氧核糖核苷酸！他們利用DNA進行鏈延長反應時，每併入一個核苷酸會產生一個氫離子(H+)，使用晶片(ISFET, ion-sensitive field-effect transistor)來偵測由於氫離子的產生造成的酸鹼度的改變（下降0.02pH），得知是否有DNA的合成。
要定序的DNA先打碎，接上帶有已知序列的adaptor DNA並固定在直徑為2微米(2μm)的珠子上，然後將珠子放進有晶片的小洞裡。
中間那個圖就是一個個小洞，下面是晶片。
藉由儀器不斷的重複加入四個核苷酸的溶液（中間當然要洗乾淨），偵測，如果使用有120萬個小洞的晶片，跑兩個鐘頭的反應可以讀出2千5百萬個鹼基對！所以大腸桿菌460萬算什麼呢？
當然可能有讀者想，如果兩個鐘頭就可以把大腸桿菌定序完，為什麼上次花了三天呢？事實上定完序列是一件事，但是要把一段段的序列組合、確認、分析，這些部分才是更花時間的。光把一堆ATGC交出來是沒有用的，要整理要分析才能發揮功用不是嗎？所以上次花了三天其實是包括瞭解這大腸桿菌不簡單，它是一個集各家所長的大腸精，這並不是定序儀可以做到的。
定序得那麼快，準確嗎？目前根據研究團隊的分析，準確度比起過去的方法是差不多的，但是光是可以在兩小時內讀出2千5百萬個鹼基對，傳統的定序就遠遠不及啊！更不用提第一次定人類基因序列時，花了3億美金定完3億個鹼基對（真是字字珠璣），以目前的第三代定序儀，未來想要瞭解你自己，可以先花個1000美金把自己的基因定序一下，再請電腦分析、分析，或許比什麼血型、星座更準確喔！
筆者想到當年當研究生的時候，花了半年的功夫定出一萬個鹼基對(10 kb)的序列，看到現在2小時就可以定2千5百萬個，真覺得自己老了....
當時的文章裡面只提到是所謂的第三代的定序儀，但沒有說第三代的定序儀是怎麼回事，畢竟它雖然不大，但也有460萬個鹼基對(base pairs)，要在三天內定序完真的是很不容易。
今天在「自然」期刊上面的一篇文章，說明了第三代定序儀是怎樣辦到的。
最早的定序，是使用同位素(磷32或硫35)標定的雙去氧核糖核苷酸(dideoxy nucleotide)，利用DNA鏈延長需要核糖上面的3號碳的OH基與下一個核苷酸上面的磷酸根反應，當我們以人工合成3號碳上帶有H基的核苷酸（雙去氧核糖核苷酸），並將它加入反應時，一旦DNA聚合酶抓到一個雙去氧核糖核苷酸後，會因為產生的DNA末端的3號碳不具有OH基，使DNA聚合反應終止。接著再用凝膠電泳把一條條DNA分開後，讓乾燥的電泳膠片上面的同位素信號在X光片上面顯影，接著就是讀出序列了。
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| 圖片來源：維基百科 |
當然，實際上我們都知道當時是很多實驗室一起做，同時技術也在進步，所以並沒有花那麼久的時間來訂出大腸桿菌的序列。
後來，開始有所謂的自動定序儀，雖然一樣是用雙去氧核糖核苷酸，但是這回這些雙去氧核糖核苷酸上面放了不同顏色的發色基，跑膠的部分則是以毛細管電泳來代替，由於這些雙去氧核糖核苷酸上面帶有不同的顏色（核苷酸只有四種，A腺嘌呤，T胸腺嘧啶，G鳥糞嘌呤，C胞嘧啶），當用雷射刺激的時候會發出不同的色光，然後由偵測器來判讀。讀出來的東西像下圖這樣：
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| 圖片來源：維基百科 |
那第三代是怎麼回事呢？第三代定序完全揚棄了使用雙去氧核糖核苷酸！他們利用DNA進行鏈延長反應時，每併入一個核苷酸會產生一個氫離子(H+)，使用晶片(ISFET, ion-sensitive field-effect transistor)來偵測由於氫離子的產生造成的酸鹼度的改變（下降0.02pH），得知是否有DNA的合成。
要定序的DNA先打碎，接上帶有已知序列的adaptor DNA並固定在直徑為2微米(2μm)的珠子上，然後將珠子放進有晶片的小洞裡。
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| 圖片網址：自然期刊網站 |
藉由儀器不斷的重複加入四個核苷酸的溶液（中間當然要洗乾淨），偵測，如果使用有120萬個小洞的晶片，跑兩個鐘頭的反應可以讀出2千5百萬個鹼基對！所以大腸桿菌460萬算什麼呢？
當然可能有讀者想，如果兩個鐘頭就可以把大腸桿菌定序完，為什麼上次花了三天呢？事實上定完序列是一件事，但是要把一段段的序列組合、確認、分析，這些部分才是更花時間的。光把一堆ATGC交出來是沒有用的，要整理要分析才能發揮功用不是嗎？所以上次花了三天其實是包括瞭解這大腸桿菌不簡單，它是一個集各家所長的大腸精，這並不是定序儀可以做到的。
定序得那麼快，準確嗎？目前根據研究團隊的分析，準確度比起過去的方法是差不多的，但是光是可以在兩小時內讀出2千5百萬個鹼基對，傳統的定序就遠遠不及啊！更不用提第一次定人類基因序列時，花了3億美金定完3億個鹼基對（真是字字珠璣），以目前的第三代定序儀，未來想要瞭解你自己，可以先花個1000美金把自己的基因定序一下，再請電腦分析、分析，或許比什麼血型、星座更準確喔！
筆者想到當年當研究生的時候，花了半年的功夫定出一萬個鹼基對(10 kb)的序列，看到現在2小時就可以定2千5百萬個，真覺得自己老了....
老師的文章愈寫愈好了!!
回覆刪除專業~